Cardiologia Hungarica
SCIENTIFIC JOURNAL of the Hungarian Society of Cardiology

Properties of several repolarizing potassium currents in atrial cadiomyocytes isolated from dogs in sinus rhythm and atrial fibrillation

█ Original article

DOI: 10.26430/CHUNGARICA.2017.47.suG.29

Authors:
Kohajda Zsófia1, Kristóf Attila1, Horváth András2, Juhász Viktor2, Sághy László3, Virág László2, Baczkó István2, Fazekas Tamás4, Varró András1,2, Jost Norbert1,2
1MTA-SZTE, Keringésfarmakológiai Kutatócsoport, Szeged
2SZTE, Általános Orvostudományi Kar, Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézet, Szeged
3SZTE, Általános Orvostudományi Kar, II. sz. Belgyógyászati Klinika és Kardiológiai Központ, Szeged
4SZTE, Általános Orvostudományi Kar, I.sz. Belgyógyászati Klinika, Szeged

Summary

Aims: The aim of the present study was to investigate the properties of three repolarizing potassium currents which contribute to atrial fibrillation (AF) – induced electrical remodelling, i.e. the transient outward (Ito), inward rectifier (IK1) and acetylcholine-sensitive (IK,ACh) potassium currents in isolated atrial myocytes obtained from dogs either with sinus rhythm (SR) or following chronic atrial tachypacing (400/min) AF-dogs.
Methods: Atrial remodelling and AF were induced by chronic (4-6 weeks of) right atrial tachypacing (400/min) in dogs. Transmembrane ionic currents were measured by applying the whole-cell patch clamp technique at 37°C.
Results: The Ito current was slightly downregulated in AF cells when compared with that recorded in SR cells. IK1 current was not statistically significant different in AF and SR cells. IK,ACh was activated by carbachol (CCh; 2 µM). In SR, CCh activated a large current either in inward or outward directions. The selective IK,ACh inhibitor tertiapin (10 nM) blocked the outward CCh-induced current by 61%. In atrial myocytes isolated from dogs with AF, the presence of a constitutively active IK,ACh was observed, blocked by 59% with 10 nM tertiapin. However, in ’AF atrial myocytes’, CCh activated an additional, significant ligand-dependent and tertiapin-sensitive IK,ACh current.
Conclusions: The presence of the constitutively active IK,ACh in atrial myocytes from AF dogs shows that electrical remodeling truly developed in this model. The IK,ACh current (both ligand-dependent and constitutively active) seems to play a significant role in canine atrial electrical remodeling, and may be a promising atrial selective drug target for suppressing AF.

ISSUE: CARDIOLOGIA HUNGARICA | 2017 | VOLUME 47, SUPPLEMENTUM G

Összefoglalás

Célkitűzés: A vizsgálat célja a pitvari repolarizációt meghatározó és a pitvarfibrillációt (PF) kísérő elektromos átépülésben szerepet játszó kálium-ionáramok (Ito – tranziens kifelé haladó kálium; IK1 – befelé egyenirányító kálium és IK,ACh – acetilkolin szenzitív káliumáram) vizsgálata volt sinusritmusú (SR) és krónikus gyors (400/perc) pitvari elektromos ingerléssel kiváltott PF-ben lévő kutyákból izolált pitvari szívizomsejtekben.
Módszerek: A kutyákon a pitvari remodellinget és PF-t krónikus (4-6 hét) gyors (400/perc) pitvari elektrostimulációval váltottuk ki. Az ionáramokat a patch clamp technika egész sejtes konfigurációjában mértük jobb pitvari szívizomsejteken 37 °C-on.
Eredmények: A PF-ben szenvedő kutyákból izolált cardiomyocytákban az Ito kis mértékben gyengült (downregulálódott). Az IK1 hasonló mértékű volt a PF és az SR sejtekben. A pitvarspecifikus IK,ACh ionáram aktiválásához carbacholt (CCh) alkalmaztunk. Az „SR-sejtekben” aktivált outward áramot 10 nM tertiapin, az IK,ACh szelektív gátlószere, 61%-ban csökkentette. A „PF-sejtekben”, minden előzetes aktiváció nélkül, jelentős, konstitutívan aktív IK,ACh áramot mértünk, amelyet a tertiapin 59%-ban gátolt. Ha a „PF-sejteket” carbachollal kezeltük, bennük a konstitutív IKACh ionáramon kívül szignifikáns ligand-függő és szintén tertiapin szenzitív IK,ACh ionáram jelent meg.
Következtetések: A konstitutív IK,ACh megjelenése is igazolja, hogy az általunk alkalmazott PF-kutyamodellben a pitvari elektromos remodelling egyértelműen kialakult. A ligandfüggő és konstitutíven aktív IK,ACh együttesen fontos szerepet játszik kutyában a PF-t kísérő elektromos átépülés kialakításában, így ígéretes antiaritmiás gyógyszertámadási célpont lehet.

Bevezetés

A pitvarfibrilláció (PF) a leggyakrabban előforduló krónikus/visszatérő ritmuszavar a klinikai gyakorlatban. PF-ben a fiziológiás körülmények (SR) között koordinált pitvari tevékenység helyett teljesen rendezetlen, kaotikus, óriási frekvenciájú (cca. 600-800/min) gyors excitáció jellemzi a pitvarok elektromos működését, amelyek lényegében véve vonaglanak, érdemi mechanikai tevékenységre (összehúzódásra és ellazulásra) képtelenek. Paroxizmális PF-ben a rendszertelenül és nemritkán (10-40%) panaszmentes formában jelentkező epizódok/attakok 7 napon belül spontánul megszűnnek, de ha a PF perzisztenssé válik, gyógyszeres terápia vagy elektromos kardioverzió szükséges a SR helyreállítására. Az SR visszaállítását célzó gyógyszeres, elektromos vagy „hibrid (gyógyszer pl. prokainamid vagy ibutilid injektálása után végzett elektrosokk) beavatkozás nem mindig sikeres, és köztudott, hogy annál kisebb a valószínűsége, hogy a betegek SR-ben maradnak, minél hosszabb ideje fennáll(t) a kardioverzió előtt a PF. Ha az SR ezen beavatkozások ellenére sem áll helyre vagy kísérlet sem történik helyreállítására (mert pl. a beteg nem egyezik bele az altatás alatt végezhető elektrokardioverzióba), a ritmuszavar állandósul, s ilyenkor a permanens jelzővel illetjük (1). Kísérletes körülmények között rövidebb-hosszabb ideig fentartott gyors pitvari elektrostimulációval PF idézhető elő, amely önfenntartó folyamatként elősegíti (elsősorban nagyobb szívvel bíró állatfajokban) saját fennmaradását. Ezt a jelenséget nevezték el Allessie és munkatársai, ma már klasszikusnak nevezhetően az atrial fibrillation begets atrial fibrillation, azaz „a pitvarfibrilláció pitvarfibrillációt szül” kifejezéssel (2).

A PF kórélettanának megismerése rendkívül sokat fejlődött az elmúlt 20 évben, amelynek során bekerült a köztudatba az atrialis remodelling, azaz a pitvari átépülés fogalma (3). Minden, a PF során előálló pitvari strukturális/szerkezeti, funkcionális/elektrofiziológiai és szignáltranszdukciós/biokémiai elváltozást összefoglalóan pitvari remodellingnek nevezünk. A pitvari remodellingnek számos (részben a kiváltó alapbetegségtől függő) formája/típusa van, mindemellett közös jellemzőjük, hogy elősegítik a PF kiújulását, perzisztenciáját, tartós (long-standing) perpetuációját vagy állandósulását. Lényegében véve, a PF is azokon a kamraizomzatban/szívizomsejtekben is megfigyelhető, mindenkitől ismert szívritmuszavar-keltő/fenntartó mechanizmusokon alapul, melyeket az 1. ábra szemléltet (4). Pitvarfibrillációt egyaránt okozhat gyors pitvari ektópiás tevékenység/szoliter vagy repetitív extrasystolia vagy ún. re-entry-aktivitás. A PF-et kiváltó, többnyire funkcionális (multiple wavelet)-re-entry iniciálásában és (gyakran a ritmuszavar tartós fönnmaradásában is), a repetitív pitvari ektópiás aktivitásnak/extrasystoliának kulcsfontosságú szerepe van. Már utaltunk arra, hogy minél hosszabb ideje áll fenn a PF, annál kifejezetebb az atrio-endomiokardiális és neurális (5, 6) remodelling, s több éve tartó permanens PF-ben az „átépülés” már oly mértékben a progrediál, hogy a pitvarüregek kitágulnak, a pivarizomfal pedig kötőszövet-szaporulat miatt egyre merevebb lesz (stiffnes; fibromiokardiális átalakulás). Chen és munkatársai nemcsak spontán kóros automáciára vagy triggerelt aktivitásra képes cardiomyocytákat találtak kutyák PV-szájadékaiban (a PV-ostiumokban) és a visszerekbe betüremkedő szívizomnyelvekben, hanem olyasféle re-entry-mechanizmust is, aminőt PF-ben szenvedő betegek PV-régióiban is kimutattak (7).

Mindent összevéve, a venoatrialis PF-et elindító extrasystolék (ES-k) patofiziológiai hátterében három aritmogén mechanizmus állhat:

  • kóros automácia;
  • re-entry;
  • triggerelt aktivitás.

Utóbbi lehet a PV-szájadékokból kiinduló spontán ES (fokális PF), amelyet ún. késői (DAD=delayed after depolarization) és/vagy korai (EAD=early after depolarization) utódepolarizáció indukál.

A kialakult/már meglévő pitvari remodelling további komplex (e helyütt nem részletezett) elektrofiziológia és patobiokémiai mechanizmusokon keresztül elősegíti a PF további fennmaradását megalapozó ektópiás és/vagy re-entry aktivitást. Számos kórfolyamat/betegség létezik, amely megváltoztatja a pitvarsejtek és a pitvari myocardium elektroanatómai és elektrofiziológiai tulajdonságait, e dolgozatnak ezen kórformák számbavétele nem célja. Általában véve, állatkísérletes és klinikai vizsgálatok alapján a pitvari remodelling két alapformáját különböztetjük meg. Az egyik a pitvari tachycardiától/tachyarrhythmiától indukált típus, amely dominánsan elektromos remodelling (ATR=atrial tachycardia-induced remodeling), amelyet klinikai körülmények között tachyarrhythmiák (PF, pitvarlebegés=AFlu, PSVT-K=paroxizmális supraventricularis tachycardiák) váltanak ki; a másik a pangásos szívelégtelenséghez vagy a kamraizomzat kötőszövet-szaporulattal (fibrosissal) és telődésgátlással járó megbetegedéseihez (mint amilyen pl. a hipertenzió) társuló pitvari strukturális remodelling (ASR=atrial structural remodeling). A két „remodelling-forma” éles disztinkciója magától értődően nagyon nehéz, hiszen az itt és később fölvázolt (elektro)patofiziológiai folyamatok kart karba öltve járnak.
Az a megfigyelés, hogy már a néhány hétig folyamatosan fennálló PF is képes gyökeresen megváltoztatni a pitvar elektrofiziológiai tulajdonságait és facilitálja a tachyarrhythmia fennmaradását és/vagy állandósulását, az Allessie vezette maastrichti munkacsoport „mérföldkő” elektropatológiai/elektrofizológiai felfedezése volt (1, 2). Már céloztunk arra, hogy az ATR-rel indukált PF elsősorban elektromos remodellinget idéz elő (3). Jelenlegi ismereteink birtokában egyelőre nem tudjuk, hogy az ún. long-standing perzisztens és a permanens PF okozta „remodelling-formák” között milyen (mikro)elektrofiziológiai és hisztopatológiai hasonlóságok és különbségek vannak, de az nyilvánvaló, hogy az elektroanatómiai átépülés (sejtszintű és szubcelluláris) jellemzőit nagymértékben befolyásolja a szív-ér rendszeri alapbetegség (8). Ami biztos: az ATR rövidíti az APD-t (2. ábra) (4).

E jelenség hátterében elsősorban az L-típusú Ca2+-áram (ICaL) downregulációja áll (9, 10), de fontos szerepe van az erősödő háttéráramként működő befelé egyenirányító K+-áramnak (IK1) (11), valamint a perma­nens PF-ben konstitutívan aktív acetilkolin függő kálium­áramnak (IK,ACh) (11, 12). Az ATR a Ca2+-homeosztázis károsítása révén mindenkor rontja a pitvarok sziszto­lés/kontrakciós és diasztolés/relaxációs funkcióját (13). A pitvarüregtágulat tovább növeli a re-entry körök keletkezésének valószínűségét (nagyobb a rendelkezésre álló endomiokardiális „szívizomterület”, több szimultán funkcionális re-entry keletkezésének adottak a feltételei) és az újraingerlődés perpetuációját. Mindent összevéve, a patogenezisben a tág(uló) szívpitvarok túltelődése, a vérrögképződést elősegítő pangás (sztázis), a mechanoreceptorokat serkentő falfeszülés (stretch), a kamrák elégtelen (verő- és perctérfogatot csökkentő) telítődése és diasztolés diszfunkciója, a pitvarműködés irregularitására visszavezethető pitvar-kamrai (elektromos és mechanikai) aszinkrónia és még sok más (monografikusan részletezhető) kórtani tényező játszik „interaktív” szerepet (4). Jelen dolgozat célja az „ioncsatornaszintű” remodelling jellemzése.

Az ATR-ben bekövetkező elektromos remodelling során jelentősen megváltozik számos transzmembrán ionáram tulajdonsága, konduktanciája. Ez magában fog­lalja a sejtmembrán biofizikai, kinetikai tulajdonságaiban bekövetkező eltéréseket, de megváltozhat a kationcsatornák/ionáramok antiaritmiás gyógyszerek iránti érzékenysége, ami akár azt is jelentheti, hogy a PF gyógyszer-rezisztenssé válik vagy éppen egy új, pitvarspecifikus (kizárólag a pitvarizomzatban jelenlévő ioncsatornára ható) ágenssel az eddigieknél hatásosabban megelőzhető és/vagy megszüntethető (3). Számos vizsgálat igazolta, hogy perzisztens PF-ban több Na+- és K+-csatorna gátló antiaritmikum hatása, sinusritmust helyreállító képessége gyengül (15, 16, 17), ami azzal a régi klinikai megfigyeléssel is összhangban van, hogy minél koraibb a PF diagnózisa, annál nagyobb a farmakológiai kardioverzió sikeraránya (15). Az eddig felvázoltak alapján az ATR potenciális antiaritmiás gyógyszercélpont (pharmacological target) lehet. Ahhoz viszont, hogy új, az ATR megelőzésére és/vagy megszüntetésére alkalmas antiaritmiás gyógyszereket fejlesszünk ki, szükség van olyan állatkísérletes modellekre, amelyek alkalmasak az új gyógyszerjelöltek ATR-re kifejtett hatásának preklinikai elemzésére. Meglepő módon, a széleskörűen alkalmazott állatkísérletes modelleken (patkány, tengerimalac, nyúl, kutya, kecske) végzett munka során szerzett tapasztalatok és mérések jóvoltából pontosabban ismerjük a humán pitvari ionáramokat (mint a kamraiakat). Több olyan PF-modell létezik, amely alkalmas az ATR-re kifejtett (gyógyszer)hatás(ok) vizsgálatára, jellemzésére. Ezek lényege, hogy a kísérleti állatok (kutya, kecske) szívét viszonylag hosszú ideig nagy frekvenciával mesterségesen ingereljük.

Kísérleteink célja a pitvari repolarizációban és PF-ben előálló elektromos átépülésben (remodelling) szerepet játszó kálium-ionáramok (Ito-tranziens kifelé haladó kálium, IK1-befelé egyenirányító kálium és IK,ACh-acetilkolin szenzitív káliumáram) tanulmányozása volt. Méréseinket SR-ben lévő és gyors pitvari ingerléssel kiváltott PF-ben szenvedő kutyákból izolált pitvari szívizomsejteken végeztük.

Eszközök és módszerek

Kísérleti állatok
A kísérleteket hím, 12-13 kg tömegű Beagle kutyák szívéből izolált pitvari szívizomsejteken végeztük. Az experimentációt a Szegedi Tudományegyetem Munkahelyi Állatkísérletes Bizottsága (MÁB) és a Csongrád Megyei Kormányhivatal Élelmiszerlánc Biztonsági és Állategészségügyi Igazgatósága engedélyezte (I-74-6/2012 MÁB ill. XIII/1211/2012 számokon).

„Tachypacelt” PF kutyamodell
Kísérleteinket a korábbiakban leírt módszerek (14) szerint végeztük. Xylazin (indukció: 1 mg/ttkg iv., fenntartó adag 0,2 mg/ttkg iv. 20 percenként) és ketamin (indukció: 10 mg/ttkg iv., fenntartó dózis 2 mg/ttkg, iv. 20 percenként) anesztézia bevezetése után az állatok kétoldali szubkután zsebbe helyezett pacemaker-t (Logos, Karios; Biotronik Hungaria Kft.) helyeztünk, amelyeket a jobb kamrába és jobb pitvarba felvezetett, majd rögzített pacemaker-elektródákhoz csatlakoztattunk. Az állatokon az atrioventricularis (AV) csomó rádióhullámú transzkatéteres ablációjával harmadfokú AV-blokkot hoztunk létre, hogy az elektromosan ingerelt pitvarok gyors (400/perc) elektromos működésének/impulzusainak kamrákra való „lefutását” megakadályozzuk. Az állatokon a kamrai pacemaker által vezérelt szívfrekvenciát az adott állaton műtét előtt mért normális/nyugalmi szívfrekvenciára állítottuk be (±80-90/perc). A műtétet követő hetedik napon a jobb pitvari pacemakert, előzetes ERP-mérés uán, bekapcsoltuk, majd 400/perc frekvenciával gyors jobb pitvari ingerlést kezdtünk az elektromos remodelling létrehozása céljából, amelyet korábbi vizsgálataink szerint a jobb pitvari ERP 80 ms-nál rövidebb időtartama jelzett. A tartós és gyors pitvari elektrostimuláció okozta elektromos remodelling dacára az SR-kutyában nemritkán helyreáll; ilyenkor 800/perc frekvenciával 10 másodperces pitvari „burst” ingerléssel reindukáltuk a PF-et. A pacemaker-ek működésének szabályozása ICS 3000 Programmer (Biotronik Hungaria Kft.) segítségével történt.

Jobb pitvari szívizomsejtek izolálása
A kutya jobb pitvari szívizomsejtjeinek izolálását enzimatikus úton végeztük. A kísérleti állatokat előzetes szedálás (xylazin, 1 mg/ttkg iv. és ketamin, 10 mg/ttkg iv.) után pentobarbitállal (Sigma-Aldrich, 30 mg/ttkg iv) (el)altattuk, majd a szívet jobb oldali lateralis thoracotomia során gyorsan eltávolítottuk. Az állatok a szívkivétel előtt 400 NE/kg Na-heparint kaptak. A szíveket 4 °C hőmérsékletű fiziológiás tápoldatban átöblítettük. A jobb pitvar perfúzióját a jobb arteria coronariába vezetett branülön keresztül végeztük 60 cm magas Langendorff perfúziós berendezésen. A jobb pitvart a következő oldatokkal perfundáltuk: 1 mM Ca2+ és 1 ml heparint tartalmazó izolációs oldattal (5 percig), Ca2+-mentes izolációs oldattal (10 percig), Ca2+-mentes izolációs oldattal (40 percig), amelyhez kollagenázt (Clostridium histolyticum type I, 0,54 mg/ml Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA), 0,1% BSA-t (bovine serum albumin fraction V; Sigma Chemical), a 15. percben proteázt (type XIV, 0,05 mg/ml; Sigma Chemical) adtunk. Ezt követően a jobb pitvart levettük a berendezésről, apró darabokra vágtuk, és 1 mM Ca2+, 1% BSA (bovine serum albumin fraction V; Sigma Chemical) tartalmú oldatba helyeztük (15 percig pihentettük 37 °C-on). A szövetdarabokat szuszpendáltuk és megkaptuk az egyedüli pitvari szívizomsejteket. Az egész izolációs eljárás alatt az oldatokat 100% O2-vel buborékoltattuk, g a hőmérsékletet 37 °C-on tartottuk. A sejteket 10 percig ülepítettük, majd ezt követően eltávolítottuk a felülúszót és friss oldatot adtunk hozzá. Ezt a folyamatot 3 alkalommal megismételtük. A sejteket mérésig szobahőmérsékleten állni hagytuk.

Az izoláció során alkalmazott oldat (mM/l): NaCl: 135 KCl: 4,7, KH2PO4: 1,2, MgSO4: 1,2, HEPES: 10, glükóz: 10, taurin 20; NaHCO3 4,4; Na-piruvát; 5, pH 7,2 (NaOH-val beállítva).

Mérési eszközök, technikák
A sejteket Olympus IX51 típusú inverz mikroszkóp asztalához rögzített szervfürdőbe helyeztük, amit normális hőmérsékletű, 36-37 °C-os Tyrode oldattal (NaCl: 144 mM/l, KCl: 4,0 mM/l, NaH2PO4: 0,4 mM/l, MgSO4: 0,53 mM/l, HEPES: 5 mM/l, glükóz: 5,5 mM/l, CaCl2:1,8 mM/l; pH 7,4 NaOH-val beállítva) áramoltattunk át (3. ábra). A 2,0-2,5 MW ellenállású patch clamp mikropipettát a következő oldattal töltöttük fel (mM/l): K-aszpartát: 100 mM/l, KCl: 45 mM/l, MgATP: 3 mM/l, MgCl2: 1 mM/l, EGTA: 10 mM/l, HEPES: 5 mM/l (pH: 7,2, KOH-al beállítva). A membránáramokat Axopatch 200B típusú patch clamp erősítővel (Molecular Devices; Union-City, USA), a patch clamp technika egészsejtes (whole-cell) konfigurációjában mértük. A sejtek kapacitását 10 mV-os hiperpolarizáló pulzus segítségével, –90 mV holding potenciálról (az a potenciálérték, amelyen a sejtet két egymást követő feszültséglépcső után tartjuk) határoztuk meg. A mérések folyamán a 4-8 MW-os ellenállást 50-80%-ig kompenzáltuk. Azoknak a kísérleteknek az eredményeit, ahol a soros ellenállás a mérés folyamán jelentősen megemelkedett, kihagytuk az értékelésből. A membránáramokat 333 Hz-es szoftvervezérelt (Axon pClamp 10.3) analóg-digitális kártya (Digidata 1440, Molecular Devices) segítségével digitálisan mértük, és rögzítettük. Az áramméréseket ugyanazon szoftver segítségével (Axon pClamp 10.3) értékeltük. A kísérleteket fiziológiás hőmérsékleten (37 °C) végeztük.

A mérések során a különböző áramokat szelektív gátlószereik segítségével azonosítottuk, illetve gátoltuk. Az alkalmazott gátlószerek:

  1. Nisoldipin, 1µM – Ica-áram-blokkoló.
  2. Dofetilid, 0,1 µM – IKr-áram-blokkoló.
  3. HMR 1556, 0,5 µM – IKs-áram-blokkoló.
  4. Tertiapin, 10 nM – IK,ACh-áram-blokkoló.
  5. 4-aminopyridin (4-AP) – Ito-áram-blokkoló.

Statisztika
Az adatok (átlag±SEM) statisztikai elemzése egymintás Student t-próbával történt. A p-értéket akkor tekintettük szignifikánsnak, ha értéke kisebb volt, mint 0,05.

Eredmények

Tranziens kifelé haladó káliumáram (Ito)
A tranziens kifelé haladó káliumáramot két kísérletes protokoll segítségével is megvizsgáltuk. Először egy, az áram kinetikai paramétereit jobban modellező, ún. akciós potenciálszerű protokollal mértük. Az Ito-áramot magas koncentrációjú 4-aminopyridin (3 mM 4-AP) gátlószerével azonosítottuk. Így az áramot a kontrollkörülmények (3. A ábra, bal felső mező) és a gátlószer után (3. A ábra bal alsó mező) regisztrált áramgörbék különbségeként (3. A ábra jobb oldali mező) határoztuk meg.

Az Ito-t a szokásos négyszögpulzusokkal aktivált áramként is megvizsgáltuk. Ennek során az Ito-áramot 0,33 Hz pulzusfrekvencia mellett négyszögjel formájú 300 ms időtartamú depolarizáló feszültségimpulzusokkal aktiváltuk, és a –20 mV-tól 50 mV-ig terjedő potenciáltartományt vizsgáltuk.

A holding potenciál (HP) –90 mV volt (3. B ábra és 4.A ábra, felső panel). A kontrollmérések során egy gyorsan aktiválódó és igen nagy amplitúdójú Ito-áramot (mintegy 14-15 pA/pF) regisztráltunk. Ezután 3 mM 4-aminopyridint adtunk az oldathoz. Azt tapasztaltuk, hogy a 3 mM 4-AP, az eddig publikált adatoknak megfelelően, teljes mértékben gátolta az Ito-áramot (3. B ábra). A kontroll és az anyag hatása utáni mérés különbségéből megkaptuk a 4-aminopiridin-érzékeny áramot. Ezután megvizsgáltuk az Ito-áramot pitvarfibrilláló (PF) kutyákból izolált pitvarsejtekben is (4. A ábra). Megállapítottuk, hogy az Ito-áram nagysága, ha kismértékben is, de csökkent („downregulálódott”). Ez a különbség nem bizonyult statisztikailag szignifikánsnak (4. A és 4. B ábrák).

Megvizsgáltuk az Ito-áram inaktivációját „SR- és „PF- sej­teken” egyaránt. A pitvarsejtekben az Ito-áram kinetikája legjobban kétkomponensű (egy gyors és egy lassabb időállandójú), exponenciális függvénnyel volt a legtökéletesebben illeszthető (5. ábra).

Kutya kamrai szívizomsejtjeiben jelen van egy rendkívül gyors (mintegy 10-12 ms időállandójú) Ito-komponens, viszont a pitvarsejtekben mért lassú(bb) kinetikájú időállandó (mintegy 120-150 ms) jelentősen lassúbb volt, mint amit korábban kutyából izolált kamrai myocytákon mértünk (+20 mV-on mérve mintegy mintegy 20-30 ms) (18) ). A „PF-sejtekben” is két exponenciális kinetikájú volt az Ito-áram inaktivációja viszont mind a gyors, mint a lassú kinetikájú komponens konstans szignifikáns mértékben lassult (5. ábra és 1. táblázat). Az illesztések eredményeit (amplitúdók és inaktivációs állandók) az 1. táblázat foglalja össze.

A befelé egyenirányító káliumáram (IK1)
A befelé egyenirányító káliumáramot a rutinszerű mikroelektrofiziológiai vizsgálatokban megszokott módon vizsgáltuk. Az IK1-áramot –90 mV holding potenciálról 0,33 Hz pulzusfrekvencia mellett 300 ms időtartamú depolarizáló négyszögimpulzusokkal aktiváltuk, és a pulzus végén nem inaktiválódó áramként (Iss, ún. „steady-state” áram) határoztuk meg (6. A ábra, szaggatott vonalakkal jelzett terület).

A 6. A ábrán is (bal oldali eredeti regisztrátum-felvételek), de a kísérleteket összesítő áramfeszültség karakterisztikákon (6. B ábra, felső panel) is jól látható, hogy a pitvari IK1-áram „PF-kutyamodellünkben” erősödik („upregulálódik”), de a növekedés a pitvari akciós potenciált meghatározó feszültségtartományban (–80 mV és 20 mV között) nem különbözik statisztikailag szignifikánsan az „SR- és PF-„ cardiomyocytákban (6. ábra jobb alsó panel).

Az acetilkolin-függő káliumáram (IK,ACh)
Az IK,ACh káliumáram fiziológiás körülmények között csak a bolygóideg stimulációja alatt aktív. Ezért az áramot a kolinerg agonista carbachol (2 µM) segítségével aktiváltuk. Az áramot egy fűrészfog (ramp) feszültségprotokoll segítségével tanulmányoztuk. SR-sejtekben kolinerg aktiváció nélkül mind befelé (inward), mind kifelé haladó (outward) irányban viszonylag alacsony amplitúdójú áramot mértünk (7. ábra). Amennyiben a tápoldathoz hozzáadtunk 2 µM carbacholt, az áram nagysága mind inward, mint az outward irányban jelentősen megnőtt (7. ábra).

Az így aktiválódott áramot a szelektív IK,ACh-gátlónak tartott tertiapin (10 nM) jelentős mértékben gátolta (7. ábra). „PF-sejtekben” minden előzetes aktiváció nélkül jelentős, konstitutívan aktív IK,ACh-áramot mértünk, amelyet a tertiapin 26%-ban gátolt (7. ábra, középső mezők). Ezzel igazoltuk kutyából izolált szívizomsejteken is azt a korábbi megfigyelést, hogy humán permanens PF-ben szenvedő betegekben jelen van egy ligand független konstitutív IK,ACh-áram is, amely feltehetőleg jelentős mértékben hozzájárul a humán pitvari elektrofiziológiai remodellinghez (12). Ha a „PF-sejteket” carbachollal kezeltük, a konstitutív IK,ACh-ionáramon kívül egy másik, szintén tertiapin-szenzitív, de ligandfüggő IK,ACh-ionáram jelent meg (7. ábra, jobb oldali mezők).

Megbeszélés

Tranziens kifelé haladó káliumáram (Ito)
Kísérletes eredményeink egyértelműen igazolják egy jelentős (mintegy 14-15 pA/pF) amplitudójú tranziens kifelé haladó káliumáram jelenlétét kutya pitvari szívizomsejtjeiben. Ennek az áramnak a jelenléte okozza a pitvarsejtek akciós potenciáljára nagyon jellemző spike and dome-konfigurációt is (2. ábra; SR pitvari sejt akciós potenciál). A kísérletesen előidézett PF-től sújtott kutyák szívéből izolált myocytákban hasonló méretű Ito-áramot mértünk. Ez a megfigyelés jelentősen eltér a PF-ben szenvedő páciensek pitvari szívizomsejt-mintáiban mért eredményektől: emberben az Ito natív áramnak mind a sűrűsége, mind az áramot alkotó fehérje és a kódoló mRNS-szintjei jelentősen mérséklődnek („downregulálódnak”). Ezen különbség (ember vs. kutya) okát nem tudjuk. Egy korábbi, a miénkhez hasonló kutyamodellben, 6 hétig folyamatosan fenntartott gyors szívingerléssel kiváltott PF-es állatrokból izolált szívizomsejteken kimutatták az Ito-áramot meghatározó Kv4.3 mRNS-szintek „downregulációját” (19). Az említett vizsgálatban nem mértek közvetlenül natív Ito-áramot, és mint tudjuk, az Ito-áram több pórusformáló a-alegység (Kv4.2, Kv4.3 és Kv1.4) és kiegészítő ß-alegység (KChIP2, miRP1 stb.) koexpressziójából áll össze (20). Természetesen az a lehetőség sem kizárt, hogy az általunk alkalmazott 4-6 hétig fönntartott gyors szívingerlés (400/min) nem elégséges az Ito-áram humán krónikus vagy permanens PF-ben észlelhető „downregulációjának” reprodukciójához, vagy az eltérés oka egyszerűen species különbség.

Az Ito-áram inaktivációs kinetikáját kétexponenciális függvénnyel illesztettük. Méréseink eredménye alapján az Ito-áram kinetikája egy gyors (t~12 ms) és egy lassúbb (t~122-150 ms) komponensből tevődik össze. Ez jelentősen eltér a kamrai szívizomsejtekben kimutatott áramkinetikai értékektől, ahol a gyors kinetika állandója hasonló a pitvaréhoz (t~4-5 ms), de a lassú összetevő jelentősen gyorsabb (t~20-25 ms), mint a pitvari érték (18). Ebből a megfigyelésből arra a fontos következtetésre juthatunk, hogy pitvaron az Ito-áram nemcsak a korai 1. fázis repolarizációt determinálja, hanem a mintegy 100-150 ms hosszú lassú komponens(e) révén szerepet játszhat a pitvarsejtek későbbi repolarizációjában. A pitvarfibrilláló kutyák Ito-ja szintén két exponenciális függvénnyel illeszthető. Mindkét komponens időállandója valamelyest lassúbb lett, ami részlegesen hozzájárulhat a pitvari akciós potenciál remodellinghez.

Befelé egyenirányító káliumáram (IK1) vizsgálata
A befelé egyenirányító káliumáram legfontosabb szerepe a késői repolarizáció utáni fázisban a membránpotenciál helyreállítása (21), de újabb tanulmányok kimutatták, hogy közvetlen szerepe lehet az akciós potenciál 3. fázisának alakításában, azaz a késői repolarizációban is (22). Eredményeink alapján az IK1-áram egyaránt jelen van az SR-ben és kísérletesen indukált „PF-es kutyák pitvari myocytáiban. Utóbbiban (ti. PF-ben) az IK1-áram enyhén erősödik („upregulálódik”), ami hasonló a humán krónikus „PF-sejtekben” mért adatokkal (11), amelyek arról tanúskodnak, hogy az IK1-áram denzitása, és az áram karakterisztikumai meghatározó fehérje és mRNS-szintek egyaránt erősödnek („upregulálódnak”). Érdemes megjegyezni, hogy kísérleteinkben az IK1-áram sűrűségének növekedése a pitvari akciós potenciált meghatározó feszültségtartományban (–80 mV és 20 mV között) nem különbözik statisztikailag szignifikáns módon az „SR-es és PF-es” kutyákból izolált pitvari myocytákban (–80 mV és 20 mV között) (6. ábra alsó panel).

Az acetilkolin-függő káliumáram (IK,ACh)
Pitvari szívizomsejtekben létezik egy speciális háttér egyenirányító káliumáram, amely nem expresszálódik a kamrasejtekben. Ez az acetilkolin szenzitív káliumáram, az IK,ACh (23). A n. vagus (paraszimpatikus)-izgalom kapcsán felszabaduló acetilkolin (ACh) stimulálja a muszkarin-receptorokat és azok aktiválják az IK,ACh-áramot (24). Eddigi ismereteink szerint az IKA,Ch-áram a ligand stimulációja nélkül inaktív. Köztudott, hogy az extrinszik és intrinszik vegetatív (autonóm, szimpatikus/paraszimpatikus) idegrendszer döntő mértékben hozzájárul a PF kialakulásához és/vagy fennmaradásához. Tudjuk, hogy a bolygóideg-izgalom hatására a pitvari APD és ERP rövdül, és az ACh egyenlőtlen felszabadulása miatt (is) növekszik a pitvari repolarizáció diszperziója/inhomogenitása (25). A paraszimpatikus izgalom arrhythmogen „táptalaja” a re-entry-rotorok keletkezésének és a PF fellépésének (1, 26), amely gyakran előfordul a klinikai gyakorlatban az ún. vagotóniás/Coumel-típusú PF-ben (27, 28). Természetesen felvetődő kérdés, hogy a vagus-izgalomtól (alvás, posztprandiális állapot stb.) indukált PF kialakulásában az IK,ACh-áram intenzitásának változása, „remodellingje” is szerepet játszik. Dobrev és munkatársai 2001-ben kimutatták, hogy az IK1-áram „upregulációjával” párhuzamosan az IK,ACh-áramot meghatározó GIRK4-fehérje expressziója csökken, ezért az IK1 „upregulációjával” és ICaL erősségének csökkenésével magyarázták az ATR-t (11). Később ugyanez a munkacsoport kimutatta, hogy ATR során nem csupán az ICaL-áram expressziója csökken, hanem, egyelőre részleteiben még nem teljesen tisztázott foszforilációs-szignalizációs mechanizmus kapcsán (29) permanens PF-ben az IK,ACh-csatornák, előzetes ligand-stimuláció nélkül, „konstitutívan” nyitva maradnak (12, 30). Ez egy meglepő eredmény volt, mert ez volt az első olyan vizsgálat, amely igazolta, hogy az IK,ACh-csatornák előzetes ligand-stimuláció nélkül is képesek aktív áram-átvitelre speciális aritmiaformá(k)ban (pl. permanens PF-ben). Ez a konstitutívan aktív IK,ACh-áram tehát hozzájárul az PF-re jellemző rövid és háromszögesített („trianguláris”) APD-morfológiához (lásd 2. ábra) (PF pitvari szívizomsejt akciós potenciál), és vélhetően szerepet játszik a pitvari re-entry típusú aritmogenezisben (12). A pitvarspecifikus (csak a pitvarizomzatban jelenlévő) IKACh-gátlás (pl. tertiapinnal) nem okoz kamrai repolarizáció megnyúlást, így valószínű, hogy nem várható olyan proaritmiás mellékhatás (Torsades de Pointes kamrai tachycardia), amilyet a jelenleg (egyre ritkábban) használt „klasszikus” IKr-gátlók (pl. dofetilid) okoznak (31). Ennek megfelelően többször felvetődött a hipotézis, hogy ezen konstitutívan aktív IK,ACh-áramnak a szelektív inhibItorai ideális pitvarspecifikus antiaritmiás hatású gyógyszerek lehetnének, amelyek alkalmasak a paraszimpatikus izgalomtól iniciált PF gyógyszeres terápiájára (12, 30). A hipotézist igazolandó számos gyógyszerjelöltet próbáltak ki különféle állatkísérletes modellekben, és az előzetes eredmények bíztatóak (32, 33).

Jelen kísérleteinkben igazoltuk a konstitutív IK,ACh-áram jelenlétét (amint ez a 7. ábra középső mezőiben látható). A „PF-cardiomyocytákban” a kolinerg agonista carbachol jelenléte nélkül is identifikálható egy tertiapin-szenzitív áramkomponens (piros görbe és oszlopok), mind az inward (–100 mV-on), mind az outward tar­tományban (–10 mV-on). Ez bizonyítja, hogy az IK,ACh-áram ligandfüggetlen (acetilkolin híján is működő) típusa is „konstitutívan” jelen vant a „PF-es” kutyákból izolált pitvarizomsejtekben. Hozzá kell tenni, hogy ez az áram nagyon alacsony denzitású, különösen outward irányban, ezért megkérdőjelezhető, hogy a konstitutív IK,ACh-áram elég „erős”-e, hogy önmagában is kiváltsa a PF-re jellemző elektromos remodellinget (a markáns pitvari ERP- és APD-rövidülést).

Jelen kísérleteink alapján megengedhetőnek látszik egy új hipotézis körvonalazása. A paraszimpatikus (alap)tónus magától értődően normális körülmények között is mindig jelen van. A vagus-rostoktól/ACh-tól stimulált IK,ACh-áram tehát folyamatosan és mindig jelen van a pitvari szívizomsejtekben, amelyhez hozzáadódhat a konstitutívan aktivált IK,ACh-áram. Utóbbi „atípusos” ionáramnak szerepe lehet a PF állandósulásában a permanens típus kialakulásában. A 7. ábra jobb oldali mezőiben bemutatott kísérletek valóban azt igazolják, hogy amennyiben a pitvari remodellingel rendelkező kutyákból izolált myocytákat előzetesen carbachollal aktiváltuk, az így létrehozott áram (amely a konstitutív és carbachollal indukált a IK,ACh-áramot egyaránt tartalmazza, különösen outward irányban már elegendően nagy (7. ábra, jobb alsó panel), hogy a tertiapin blokkolása is szignifikánsan nagyobb áramkomponens jelenlétét igazolja. Ez az áram, már kellően erős lehet, hogy hozzájáruljon az PF-re jellemző trianguláris és rövid APD-hez.

E hipotézist igazolandó, a közelmúltban Juhász és mun­katársai kimutatták, hogy a tertiapin képes volt kivédeni a gyors pitvari szívingerléssel kiváltott pitvari elektromos remodelling talaján kialakuló kísérletes PF-et kutyákban (34). További humán vizsgálatok szükségesek annak igazolására, hogy az IK,ACh gátlása klinikai körülmények között is hasznosítható lesz-e a PF megelőzésében, megszüntetésében és/vagy állandósulásának profilaxisában.

Következtetések

A pitvari Ito-áram a lassú inaktivációs kinetika miatt a pitvari szívizomsejtekben jelentősebb mértékben hozzájárulhat a késői repolarizációhoz, mint amilyet a kamrai szívizomsejtekben kimutattak. Az Ito-áram kutyamodellünkben a humán adatokkal ellentétben, csak kis mértékben „downregulálódott” PF-ben, viszont inaktivá­ciós kinetikája szignifikánsan lassult.

A konstitutív IK,ACh megjelenése bizonyítja, hogy PF-kutyamodellünkben a pitvari elektromos remodelling kia­lakult. A ligandfüggő és konstitutívan aktív IK,ACh-áramok együttesen feltehetően fontos szerepet játszanak (legalábbis kutyában) az PF-re jellemző háromszög alakú, a fiziológiásnál is rövidebb akcióspotenciál-jelforma kialakításában.

Köszönetnyilvánítás
A jelen munka a Nemzeti Kutatási, Fejlesztési és Innovációs Hivatal (OTKA NN-109904, NN-110896, K-119992 és GINOP-2.3.2-15-2016-00006), a TÁMOP 4.2.4.A/2-11-1-2012-0001 azonosító számú Nemzeti Kiválóság Program (Hazai hallgatói, illetve kutatói személyi támogatást biztosító rendszer kidolgozása és működtetése országos program) és a Magyar Tudományos Akadémia támogatásával készült.
Megkülönböztetett köszönetünket szeretnénk kifejezni Prof. dr. Papp Gyula akadémikusnak, aki a jelen dolgozat szinte valamennyi szerzőjének a pályáját és szakmai tevékenységét mindvégig messzemenően támogatta.

Irodalom

1. Nattel S. New ideas about atrial fibrillation 50 years on. Nature 2002; 415: 219–26. https://doi.org/10.1038/415219a

2. Wijffels MCEF, Kirchhof CJHJ, Dorland R, et al. Atrial fibrillation begets atrial fibrillation. A study in awake, chronically instrumented conscious goats. Circulation 1995; 92: 1954–1968. https://doi.org/10.1161/01.CIR.92.7.1954

3. Nattel S. Atrial electrophysiological remodeling caused by rapid atrial activation: underlying mechanisms and clinical relevance to atrial fibrillation. Cardiovasc Res 1999; 42: 298–308. https://doi.org/10.1016/S0008-6363(99)00022-X

4. Jost N, Fazekas T. Pitvari (elektromos, kontraktilis és strukturális) remodelling. In. Pitvarfibrilláció. A szívizomsejttől a betegágyig (szerk. Fazekas T, Bogáts G, Csanádi Z, Jost N, Lőrincz I). Medicina Kiadó; 2010. pp. 91–138.

5. Lu Z, Scherlag BJ, Lin J, et al. Atrial fibrillation begets atrial fibrillation: autonomic mechanism for atrial electrical remodeling induced by short-term rapid atrial pacing.Circ Arrhythm Electrophysiol 2008; 1(3):184–192. https://doi.org/10.1161/CIRCEP.108.784272

6. Sheng X, Scherlag BJ, Yu L, et al. Prevention and reversal of atrial fibrillation inducibility and autonomic remodeling by low-level vagosympathetic nerve stimulation. J Am Coll Cardiol 2011; 57: 563–571. https://doi.org/10.1016/j.jacc.2010.09.034

7. Chen YJ, Chen SA, Chen YC, et al. Effects of rapid atrial pacing on the arrhythmogenic activity of single cardiomyocytes from pulmonary veins: implication in initiation of atrial fibrillation. Circulation 2001; 104: 2849–2854. https://doi.org/10.1161/hc4801.099736

8. Burstein B, Qi XY, Yeh YH, et al. Atrial cardiomyocyte tachycardia alters cardiac fibroblast function: a novel consideration in atrial remodeling. Cardiovasc Res 2007; 76: 442– 452. https://doi.org/10.1016/j.cardiores.2007.07.013

9. Yue L, Feng J, Gaspo R, et al. Ionic remodeling underlying action potential changes in a canine model of atrial fibrillation. Circ Res 1997; 81: 512–525. https://doi.org/10.1161/01.RES.81.4.512

10. Christ T, Boknik P, Wöhrl S, et al. Reduced L-type Ca2+ current density in chronic human atrial fibrillation is associated with increased activity of protein phosphatases. Circulation 2004; 110: 2651–2657. https://doi.org/10.1161/01.CIR.0000145659.80212.6A

11. Dobrev D, Graf E, Wettwer E, et al. Molecular basis of downregulation of G-protein-coupled inward rectifying K+ current (IK,ACh) in chronic human atrial fibrillation: decrease in GIRK4 mRNA correlates with reduced IK,ACh and muscarinic receptor-mediated shortening of action potentials. Circulation 2001; 104: 2551–2557. https://doi.org/10.1161/hc4601.099466

12. Dobrev D, Friedrich A, Voigt N, et al. The G-protein gated potassium current IK,ACh is constitutively active in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation 2005; 112: 3697–3706. https://doi.org/10.1161/CIRCULATIONAHA.105.575332

13. Sun H, Gaspo R, Leblanc N, Nattel S. Cellular mechanisms of atrial contractile dysfunction caused by sustained atrial tachycardia. Circulation 1998; 98: 719 –727. https://doi.org/10.1161/01.CIR.98.7.719

14. Schotten U, Duytschaever M, Ausma J, Eijsbouts S, Neuberger HR, Allessie M. Electrical and contractile remodeling during the first days of atrial fibrillation go hand in hand. Circulation 2003; 107: 1433–1439. https://doi.org/10.1161/01.CIR.0000055314.10801.4F

15. Courtemanche M, Ramirez RJ, Nattel S. Ionic targets for drug therapy and atrial fibrillation-induced electrical remodeling: insights from a mathematical model. Cardiovasc Res 1999; 42: 477–489. https://doi.org/10.1016/S0008-6363(99)00034-6

16. Tieleman RG, Van Gelder IC, Bosker HA, et al. Does flecainide regain its antiarrhythmic activity after electrical cardioversion of persistent atrial fibrillation? Heart Rhythm 2005; 2: 223–230. https://doi.org/10.1016/j.hrthm.2004.11.014

17. Duytschaever M, Blaauw Y, Allessie M. Consequences of atrial electrical remodeling for the anti-arrhythmic action of class IC and class III drugs. Cardiovasc Res 2005; 67: 69–76. https://doi.org/10.1016/j.cardiores.2005.02.019

18. Virág L, Jost N, Papp R, et al. Analysis of the contribution of Ito to repolarization in canine ventricular myocardium. Br J Pharmacol 2011; 164: 93–105. https://doi.org/10.1111/j.1476-5381.2011.01331.x

19. Yue L, Melnyk P, Gaspo R, et al. Molecular mechanisms underlying ionic remodeling in a dog model of atrial fibrillation. Circ Res 1999; 84: 776–784. https://doi.org/10.1161/01.RES.84.7.776

20. Jost N. Transmembrane ionic currents underlying cardiac action potential in mammalian hearts. In. Advances in cardiomyocyte research. Ed. Péter P. Nánási. Transworld Research Network, Tivandrum, Kerala, India; 2009. p. 1–45.

21. Anumonwo JMB, Lopatin AN. Cardiac strong inward rectifier potassium channels. J Mol Cell Cardiol 2010; 48: 45–54. https://doi.org/10.1016/j.yjmcc.2009.08.013

22. Biliczki P, Virág L, Iost N, et al. Interaction of different potassium channels in cardiac repolarization in dog ventricular preparations: role of the repolarization reserve. Br J Pharmacol 2002; 137: 361–368. https://doi.org/10.1038/sj.bjp.0704881

23. Heidbüchel H, Vereecke J, Carmeliet E. Three different potassium channels in human atrium: contribution to the basal potassium conductance. Circ Res 1990; 66: 1277–1286. https://doi.org/10.1161/01.RES.66.5.1277

24. Yamada M, Inanobe A, Kurachi Y. G protein regulation of potassium ion channels. Pharmacol Rev 1998; 50: 723–757.

25. Liu L, Nattel S. Differing sympathetic and vagal effects on atrial fibrillation in dogs: role of refractoriness heterogeneity. Am J Physiol 1997; 273: H805–H816.

26. Kneller J, Zou R, Vigmond EJ, et al. Cholinergic atrial fibrillation in a computer model of a two-dimensional sheet of canine atrial cells with realistic ionic properties. Circ Res 2002; 90: E73–E87. https://doi.org/10.1161/01.RES.0000019783.88094.BA

27. Yeh YH, Lemola K, Nattel S. Vagal atrial fibrillation. Acta Cardiol Sin 2007; 23: 1–12.

28. Coumel P, Attuel P, Lavallée J, et al. Syndrome d’arythmie auriculaire d’origine vagale. Arch Mal Coeur 1978; 6: 643–656.

29. Voigt N, Friedrich A, Bock M, et al. Differential phosphorylation-dependent regulation of constitutively active and muscarinic receptor-activated IK,ACh channels in patients with chronic atrial fibrillation. Cardiovasc Res 2007; 74: 426–437. https://doi.org/10.1016/j.cardiores.2007.02.009

30. Voigt N, Maguay A, Yeh xYH, et al. Changes in IK,ACh single channel activity with atrial tachycardia remodeling in canine atrial cardiomyocytes. Cardiovasc Res 2008; 77: 35–43. https://doi.org/10.1093/cvr/cvm051

31. Lengyel C, Varró A, Tábori K, Papp JG, Baczkó I. Combined phar­macological block of IKr and IKs increases short-term QT interval variability and provokes torsades de pointes. Br J Pharmacol 2007; 151: 941–951. https://doi.org/10.1038/sj.bjp.0707299

32. Hashimoto N, Yamashita T, Tsuruzoe N. Tertiapin, a selective IKACh blocker, terminates atrial fibrillation with selective atrial effective refractory period prolongation. Pharmacol Res 2006; 54: 136–41. https://doi.org/10.1016/j.phrs.2006.03.021

33. Hashimoto N, Yamashita T, Tsuruzoe N. Characterization of in vivo and in vitro electrophysiological and antiarrhythmic effects of a novel IKACh blocker, NIP–151: a comparison with an IKr-blocker dofetilide. J Cardiovasc Pharmacol 2008; 51: 162–169. https://doi.org/10.1097/FJC.0b013e31815e854c

34. Juhász V, Hornyik T, Benák A, et al, Comparison of the effects of IK,ACh, IKr and INa block in conscious dogs with atrial fibrillation and on action potentials in remodeled atrial trabeculae. Can J Physiol Pharmacol epub, 2017; https://doi.org/10.1139/cjpp-2017–0342.