Myofilament Ca2+ sensitivity correlates with left ventricular contractility during the progression of pressure overload-induced left ventricular myocardial hypertrophy in rats

█ Original article

DOI: 10.26430/CHUNGARICA.2019.49.2.88

Authors:
Ruppert Mihály^1,2, Bódi Beáta³, Nagy Dávid¹, Korkmaz-Icöz Sevil², Loganathan Sivakkanan², Oláh Attila¹, Barta Bálint András¹, Sayour Alex Ali^1,2, Benke Kálmán¹, Karck Matthias², Merkely Béla¹, Papp Zoltán^3,4, Szabó Gábor², Radovits Tamás¹
¹Semmelweis Egyetem, Városmajori Szív- és Érgyógyászati Klinika, Budapest
²Ruprecht-Karls Egyetem, Szívsebészeti Klinika, Kísérleti Kutató Laboratórium, Heidelberg
³Debreceni Egyetem, Klinikai Fiziológiai tanszék, Debrecen
⁴MTA-DE, Vaszkuláris Biológia és Miokardium Patofiziológiai Kutatócsoport, Debrecen

Summary

Aim: Here we aimed at investigating the relation between left ventricular (LV) contractility and myofilament function during the development and progression of pressure overload (PO)-induced LV myocardial hypertrophy (LVH).
Methods: Abdominal aortic banding (AB) was performed to induce PO in rats for 6, 12 and 18 weeks. Sham operated animals served as controls. Structural and molecular alterations were investigated by serial echocardiography, histology, quantitative real-time PCR and western blot. LV function was assessed by pressure-volume analysis. Force measurement was carried out in permeabilized cardiomyocytes.
Results: AB resulted in the development of pathological LVH as indicated by increased heart weight-to-tibial length ratio, LVmass index, cardiomyocyte diameter and fetal gene expression. These alterations were already present at early stage of LVH (AB-week6). Furthermore, at more advanced stages (AB-week12, AB-week18), myocardial fibrosis and chamber dilatation were also observed. From a hemodynamic point of view, the AB-wk6 group was associated with increased LV contractility, maintained ventriculo-arterial coupling (VAC) and preserved systolic function. In the same experimental group, increased myofilament Ca2+ sensitivity (pCa50) and hyperphosphorylation of cardiac troponin-I (cTnI) at Threonine-144 was detected. In contrast, in the AB-wk12 and AB-wk18 groups, the initial augmentation of LV contractility, as well as the increased myofilament Ca2+ sensitivity and cTnI (Threonine-144) hyperphosphorylation diminished, leading to impaired VAC and reduced systolic performance. Strong correlation was found between LV contractility parameters and myofilament Ca2+-sensitivity among the study groups.
Conclusion: Changes in myofilament Ca2+ sensitivity might underlie the alterations in LV contractility during the development and progression of PO-induced LVH.

ISSUE: CARDIOLOGIA HUNGARICA | 2019 | VOLUME 49, ISSUE 2

Összefoglalás

Bevezetés: A bal kamra (BK) hosszan tartó nyomásterhelésének hatására patológiás BK-hipertrófia (BKH) fejlődik ki, amely idővel szívelégtelenség kialakulásához vezethet. Korábbi kísérletes munkák igazolták, hogy a patológiás BKH különböző stádiumaiban jellegzetes változások figyelhetők meg a BK kontraktilitásában és a miofilamentáris rendszer funkciójában egyaránt. Jelen tanulmányunk célja a BK-i kontraktilitás és a miofilamentáris funkció ezen változásai közötti kapcsolat feltárása volt a fokozott nyomásterhelés által indukált BKH patkánymodelljében.
Módszerek: Állatkísérletünkben a fokozott nyomásterhelést az abdominális aorta műtéti beszűkítésével (abdominal aortic banding, AB) biztosítottuk 6, 12, illetve 18 hét időtartamra. A kontrollcsoportokat áloperált állatok alkották. A szív morfológiai és molekuláris változásait echokardiográfiás utánkövetéssel, szövettani vizsgálatokkal, kvantitatív valós idejű PCR-rel és Western blot technikával vizsgáltuk. A BK-funkciót nyomás–térfogat-analízissel határoztuk meg. A miofilamentáris rendszer funkcióját permeabilizált szívizomsejteken történő erőmérésekkel vizsgáltuk.
Eredmények: A fokozott nyomásterhelés az aortaszűkített csoportokban jelentős mértékű BKH kialakulását eredményezte, amelyet makroszkópikusan (emelkedett tibiahosszra normalizált szívtömeg és BK-szívtömegindex), mikroszkópikusan (emelkedett szívizomrost-harántátmérő) és génexpressziós szinten (fötális génprogram reaktiváció) egyaránt igazoltunk. Ezen változások már a BKH korai stádiumában jelen voltak (AB-6hét csoport). Emellett az előrehaladottabb stádiumokban (AB-12hét és AB-18hét) a miokardiális fibrózis fokozódása és a kamra dilatációja is megfigyelhetővé vált. Hemodinamikai szempontból az AB-6hét csoportra emelkedett BK-i kontraktilitás, megtartott ventrikulo-arteriális kapcsolás és megőrzött szisztolés kamrafunkció volt jellemző. Ugyanebben a csoportban a miofilamentáris rendszer emelkedett Ca2+-érzékenysége (pCa50) és a kardiális troponin-I (cTnI) treonin-144 oldalláncának hiperfoszforilációja volt megfigyelhető. Ezzel ellentétben az AB-12hét és AB-18hét csoportokban a megnövekedett BK-i kontraktilitás regresszióját valamint a miofilamentáris rendszer fokozott Ca2+-érzékenységének és a cTnI hiperfoszforilációjának csökkenését tapasztaltuk, amely a ventrikulo-arteriális kapcsolás romlásához és szisztolés teljesítménycsökkenéshez vezetett. Erős összefüggést találtunk a BK-i kontraktilitás és a miofilamentáris Ca2+-érzékenység között.
Következtetések: Eredményeink arra utalnak, hogy a miofilamentáris rendszer Ca2+-érzékenységében bekövetkező változások hozzájárulhatnak a BKH progressziója során megfigyelhető kontraktilitásváltozásokhoz.

Bevezetés

A bal kamra (BK) hosszan tartó nyomásterhelésének hatására patológiás BK-hipertrófia (BKH) fejlődik ki, amely idővel szívelégtelenség kialakulásához vezethet. A patológiás BKH létrejötte és progressziója során jellegzetes változások figyelhetők meg a BK kontraktilitásában. A kontraktilitás definíció szerint a szívizom elő- és utóterheléstől független összehúzódó képességét jelenti (2). Jelenleg a BK-i kontraktilitás in vivo körülmények között történő meghatározására az egyik legjobban elfogadott módszer a nyomás-térfogat analízis (3).

Korábbi kísérletes munkák rávilágítottak arra, hogy a nyomás-térfogat analízissel számítható kontraktilitásparaméterek jelentős mértékben fokozódnak a BKH korai stádiumában (4–6). A kontraktilitás növekedése biztosítja, hogy a szív képes legyen kompenzálni az artériás rendszerben uralkodó fokozott utóterhelést (fiziológiás ventrikulo-arteriális kapcsolás, VAC) (7). Így a BKH korai stádiumára megtartott szisztolés funkció jellemző.

A témában folytatott alapkutatásoknak köszönhetően szintén ismert, hogy a kontraktilitás korai növekedése BKH-ban csak ideiglenes alkalmazkodást tesz lehetővé, ugyanis előrehaladottabb stádiumokban a kontraktilitás romlik (6, 8). A kontraktilitás fokozódásának regressziója a változatlanul emelkedett artériás utóterhelés ineffektív ellenregulációját eredményezi, amely a szisztolés teljesítmény csökkenésében nyilvánul meg.

A közelmúlt kutatási eredményei arra engednek következtetni, hogy a fokozott nyomásterhelés hosszú távú fennállása a BK kontraktilitását nemcsak szervi szinten érinti, hanem a szarkomerfunkcióban is változásokat idéz elő. Megtartott szisztolés funkcióval jellemzett BKH kisállatmodelljében a miofilamentáris rendszer Ca2+-érzékenységének (pCa50) fokozódást figyelték meg (9). A BKH előrehaladottabb stádiumaiban viszont súlyosan károsodott szisztolés funkciót és a miofilamentáris Ca2+-érzékenység valamint a maximális szarkomer erő (Fmax) csökkenését írták le (10, 11).

A permeabilizált szívizomsejteken végzett in vitro erőmérések és az in vivo BK-i nyomás-térfogat analízis alapján felmerül, hogy a BKH progressziója során dinamikus változások játszódnak le a szarkomerfunkcióban is (pCa50 és/vagy Fmax). Korábbi tanulmányok ugyanakkor nem vizsgálták a permeabilizált szívizomsejtek működésében bekövetkező stádiumfüggő változásokat. Szintén nem ismert kísérletes eredmény a BK-i kontraktilitás és a miofilamentáris funkció közötti kapcsolat jellemzéséről BKH-ban.

Fentiek alapján, jelen patkánykísérletünk célja a BK-i kontraktilitás és a miofilamentáris funkció egyidejű meghatározása volt fokozott nyomásterhelés által indukált BKH kialakulása és progressziója során.

Módszerek

Állatok
Sprague–Dawley-patkányokat (n=67; 5-6 hetes korú; 160-180 g súlyú; Janvier, Franciaország) szabványos laboratóriumi körülmények között tartottunk. Vizsgálatainkat a kísérleti állatok tartásáról és felhasználásáról szóló nemzetközi szabályoknak (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, US National Institues of Health 1996; 85–23) megfelelően végeztük, a Baden-Württembergi állatetikai bizottság külön engedélyével (engedély kódszáma: G-94/15).

A hasi aorta műtéti beszűkítése: abdominális aortic banding
Egyhetes akklimatizációs idő leteltével az állatokon hasi aorta műtéti beszűkítését (abdominális aortic banding; AB) vagy áloperációt (Sham) hajtottunk végre (7). Az AB operáció során az aorta abdominális szakaszát, a suprarenalis síkban egy 22 G-s tű külső átmérőjével megegyező szélességűre szűkítettük (n=39). A Sham-állatok (n=28) azonos eljáráson mentek keresztül, az aorta beszűkítésétől eltekintve. A műtét után jelentkező fájdalom csillapítására buprenorfin (0,05 mg/kg dózisban) injekciót alkalmaztunk.

Kísérleti csoportok
A műtéteket követően állatainkat az alábbi hat csoportba osztottuk:

AB-6hét (n=13): a csoport tagjait az aortaszűkítést követően 6 hétig,
Sham-6hét (n=9): a csoport tagjait az áloperációt követően 6 hétig,
AB-12hét (n=13): a csoport tagjait az aortaszűkítést követően 12 hétig,
Sham-12hét: (n=9): a csoport tagjait az áloperációt követően 12 hétig,
AB-18hét (n=13): a csoport tagjait az aortaszűkítést követően 18 hétig,
Sham-18hét: (n=10): a csoport tagjait az áloperációt követően 18 hétig követtük.

Echokardiográfia
A vizsgálatokat a korábbiakban ismertetett protokoll alapján hajtottuk végre (7). Az ultrahangos felvételeket izoflurán anesztézia mellett, a Vevo® 2100-as rendszerhez (FujiFilm VisualSonics Inc. Toronto, Ontario, Kanada) kapcsolt 21 MHz-es lineáris fejjel végeztük. Kétdimenziós parasternalis hosszú és rövid, valamint a papilláris izmot középen metsző M-módú felvételeket készítettünk, majd ezeket szoftveres kiértékelésnek vetettük alá. Méréseinket a műtétek előtt (baseline időpillanat) majd a műtéteket 3, 6, 9, 12, 15 és 18 héttel követően hajtottuk végre az AB-18hét és a Sham-18hét csoportokban. A következő paramétereket határoztuk meg: BK elülső falvastagság (AWT), BK hátulsó falvastagság (PWT) diasztoléban (d) és szisztoléban (s), valamint BK végdiasztolés- (LVEDD) és végszisztolés (LVESD) belső átmérő. Minden mérést háromszor hajtottunk végre, eredményeiket átlagoltuk. A BK-i szívizomtömeget (LVmass) a testtömegre normalizált index (LVmass index) formájában adtuk meg.

Nyomás-térfogat analízis
A patkányokat izoflurán gáz alkalmazásával elaltattuk, majd tracheotomia és intubáció után mesterségesen lélegeztettük. Az állatok testhőmérsékletét a kísérlet során végig 37 °C-on tartottuk. A hemodinamikai mérést egy nyomás-konduktancia mikrokatéter alkalmazásával (SPR-838, Millar Instruments, Houston, Tx, USA) hajtottuk végre (7). Meghatározásra kerültek: szisztolés (SBP) és diasztolés artériás vérnyomás (DBP), artériás középnyomás (MAP), maximális és minimális dP/dt (dP/dtmax, dP/dtmin), BK-i végszisztolés (LVESV) és végdiasztolés (LVEDV) térfogatértékek, verőtérfogat (SV), ejekciós frakció (EF), szívfrekvencia (HR), perctérfogat (CO), verőmunka (SW), artériás elasztancia ([Ea], a következő képlet alapján (Ea=LVESP/SV)] (12), BK aktív relaxáció időkonstans (Tau, a Glantz-képlet alapján) (13). A vena cava inferior kompressziója mellett továbbá a következő kontraktilitás paramétereket számítottuk: végszisztolés nyomás-térfogat kurvilineáris összefüggés meredeksége (ESPVR) (14), verőmunka – végdiasztolés térfogat (EDV) összefüggés meredeksége (az ún. preload recruitable stroke work, PRSW) és a dP/dtmax – EDV összefüggés meredeksége (dP/dtmax–EDV). A miokardiális stiffness-t a végdiasztolés nyomás–térfogat-összefüggés (EDPVR) egyenesének meredekségével jellemeztük. A BK működésének hatékonyságát a ventrikulo-arteriális kapcsolás (VAC) alapján ítéltük meg (VAC=Ea/ESPVR) (15). A volumenszignál kalibrációját a korábban leírt módszerrel végeztük (3). A hemodinamiaki mérések végeztével az állatokat kivéreztetéssel eutanizáltuk. Ezt követően, a szívtömegek és a tibiahosszak kerültek meghatározásra, amelyekből a szívtömeg tibiahosszra normalizált indexét (HW/TL) számítottuk.

Permeabilizált szívizomsejtek mechanikai vizsgálata
A permeabilizált BK-i szívizomsejtek (n=10-12/csoport) mechanikai tulajdonságait egy speciális erőmérőrendszerrel határoztuk meg 2,3 μm szarkomerhossz mellett. A szívizomsejtek aktív erőértékét (Faktív) és Ca2+-érzékenységét (pCa50) maximális, (pCa=4,75) és szubmaximális (pCa=5,2–7,0) Ca2+-koncentrációk mellett regisztráltuk. A cardiomyocyták Ca2+-független passzív erejét (Fpasszív) relaxáló oldatban mértük (pCa=9,0), ahol a sejteket eredeti hosszúságuk 80%-ára rövidítettük. A szubmaximális Ca2+-koncentrációkon regisztrált erőértékeket (Faktív) a maximális Ca2+-koncentráción mért aktív erőre (pCa=4,75; Fmax) normálizáltuk, amely megadta a pCa-erő összefüggés szigmoid görbéjét. Minden regisztrált erőértéket normalizáltunk a preparátum keresztmetszetére és az eredményeket kN/m²-ben adtuk meg.

Western immunoblot technika
A kardiális troponin I (cTnI) és a kardiális miozin kötő C-fehérje (cMyBP-C) specifikus oldalláncainak foszforiláltságát western blot technikával vizsgáltuk. A mérés során meghatározásra került a cTnI protein kináz A (PKA)-függő (Ser-22/23), és protein kináz-C (PKC)-függő (Ser-43-as és Thr-144) oldalláncainak valamint a cMyBPC PKA-függő (Ser-282) oldalláncának foszforiláltsági állapota.

Szövettan
Hematoxillin-eozinnal festett metszeteken a cardiomyocyták harántátmérői kerültek meghatározásra ([CD], 100 db/metszet) (16). A miokardiális fibrózis mértékét picrosirius vörössel festett metszeteken vizsgáltuk az ImageJ (Bethesdam, MD, USA) szoftver alkalmazásával (17).

BK génexpressziós vizsgálatok
A BK génexpressziós vizsgálatára kvantitatív, valós idejű polimeráz láncreakciót (qRT-PCR) hajtottunk végre (8). A következő gének kifejeződése került meghatározásra: β-típusú miozin nehézlánc (β-MHC), α-MHC, pitvari típusú nátriuretikus peptid (ANP). A génexpressziós adatokat a housekeeping glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH) referenciagénre normalizáltuk és az expressziós szinteket a CT komparatív módszerrel (2-ΔCT) számítottuk. Valamennyi értéket pozitív kalibrátorra (a Sham-6hét csoport valamennyi mintájából létrehozott cDNS-pool) normalizálva adtuk meg [2-ΔΔCT].

Statisztika
Minden adatot átlagérték±SEM formájában adtunk meg. Az adatok normáleloszlását Shapiro–Wilk-teszttel és D’Agostino-Pearson omnibus teszttel ellenőriztük.
Két független csoport összehasonlítására, normáleloszlás esetén párosítatlan kétmintás t-próbát, míg nem normáleloszlás esetén Mann–Whitney U-tesztet alkalmaztunk.

6 független csoport összehasonlítására kétutas variancianalízist ([ANOVA]; idő és aortic banding faktorok alkalmazásával), Tukey-féle post hoc teszttel végeztünk. Azokat az adatsorokat, amelyek nem normáleloszlást mutattak, az ANOVA-teszt elvégzése előtt logaritmikusan transzformáltuk.
A sorozatos UH-vizsgálatok eredményeit csoporton belül ismétléses egyutas ANOVA-val (normáleloszlás esetén), Friedman-teszttel (nem normáleloszlás esetén) és Holm-Sidak, illetve Dunn-féle post hoc teszttel vizsgáltuk.

A pCa50 és az ESPVR, pCa50 és a PRSW, illetve a pCa50 és a dP/dtmax-EDV-paraméterek közötti esetleges korrelációt Pearson- (normáleloszlás esetén) és Spearman- (nem normáleloszlás esetén) teszttel vizsgáltuk.

A p<0,05 értékeket tekintettük statisztikailag szignifikánsnak. Bevezetésre kerültek tovább a p<0,01 és p<0,001 kategóriák is a statisztikai erő jelölése érdekében.

Eredmények

A fokozott nyomásterhelés által előidézett BKH echokardiográfiás követése
A 3. héttől a kísérlet végéig az AWTd, PWTd és LVmass index- értékek folyamatos növekedést mutattak az AB-18hét csoportban a Sham-18hét csoporthoz képest, amely a BKH kialakulását igazolta (1. B–D ábrák). A 12. a 15. és a 18. héten továbbá a LVEDD is növekedést mutatott, ami a BK dilatációját jelezte (1. E ábra).

Patológiás hipertrófia és fibrózismarkerek
Az AB-6hét, AB-12hét és AB-18hét csoportokban a HW/TL és CD növekedett a megfelelő Sham-csoportokhoz képest (2. B–C ábrák). A β/α-MHC génexpressiós arány és az ANP miokardiális mRNS-expresszió szintén fokozódott az AB-csoportokban (2. D–E ábrák). Ez a fötális génexpresszió reaktivációját jelezte. A kollagén mennyiségének fokozódása az AB-12hét és AB-18hét csoportokban intersticiális fibrózis kialakulására utalt (2. F ábra).

Miofilamentáris funkció
A pCa50 szignifikánsan nőtt az AB-6hét csoportban a Sham-6hét csoporthoz képest, ami a miofilamentum megnövekedett Ca2+-érzékenységére utalt (3. ábra). Az AB-12hét és AB-18hét csoport Ca2+-érzékenysége nem különbözött jelentősen a megfelelő Sham-csoportokétól (3. ábra). Az Fmax egyik csoportban sem mutatatott jelentős eltérést (1. táblázat).

A kardiális troponin-I és a miozin kötő C-fehérje oldallánc-specifikus foszforilációja
A cTnI foszforilációja a Ser-22/23 és a Ser-43 oldalláncokon nem különbözött a vizsgált csoportokban (4. A–B ábrák). Szintén nem találtunk különbséget a cMyBP-C foszforiláltságában a Ser-282 oldalláncon (4. D ábra). A cTnI Thr-144-es oldalláncának foszforiláltága azonban szignifikánsan emelkedett az AB-6hét csoportban a Sham-6hét, valamint a többi AB-csoporthoz képest (4. C ábra).

Balkamra-funkció
A nyomás-térfogat analízis eredményei az 5–7. ábrákon és az 1. táblázatban látható.

Artériás utóterhelés
Az SBP, DBP, MAP és Ea szignifikánsan emelkedtek az AB-csoportokban a megfelelő áloperált csoportokhoz képest, amely a fokozott nyomásterhelés jelenlétét bizonyítja az aortaszűkítéstől proximális érterületen (1. táblázat).

Konvencionális szisztolés paraméterek
Az AB-6hét csoportban megtartott szisztolés működés volt megfigyelhető. Ennek megfelelően az elő- és utóterheléstől függő szisztolés paraméterek (EF, SV, CO) értékei nem különböztek az AB-6hét csoportban a korban illesztett kontrollcsoport értékeihez képest (1. táblázat). Az AB-12hét és AB-18hét csoportokban viszont az EF szignifikánsan csökkent, míg az SV és a CO csökkenő tendenciát mutatott (1. táblázat).

Előterheléstől független BK-i kontraktilitásparaméterek
Az AB-6hét csoportban az ESPVR, PRSW és dP/dtmax-EDV jelentősen növekedtek a Sham-6hét csoporthoz képest, ami emelkedett BK-i kontraktilitást jelzett (5. A–B, 6. A–B, 7. A–B ábrák). Ez a növekedés nem volt jellemző az AB-12hét és AB-18hét csoportokra (5. A–B, 6. A–B ábrák).

Ventrikulo-arteriális kapcsolás
Az AB-6hét csoportban a BK-i kontraktilitás növekedése (ESPVR-növekedés) ellensúlyozta a megnövekedett utóterhelést (emelkedett Ea), így a VAC értéke nem különbözött a megfelelő Sham-csoportéhoz képest (1. táblázat). Ezzel ellentétben az AB-12hét és AB-18hét csoportokban a BK-i kontraktilitás-növekedés regressziója, a fokozott utóterhelés változatlan fennállása mellett a VAC romlásához vezetett (1. táblázat).

Diasztolés funkció
Az aktív relaxációs időkonstans Tau jelentősen nőtt az AB-6hét, AB-12hét és AB-18hét csoportokban a megfelelő Sham-csoportokhoz képest (1. táblázat). Az EDPVR meredeksége szintén emelkedett az AB-18hét csoportban a Sham-18 hét csoporthoz képest (1. táblázat).

Összefüggés a Ca2+-érzékenység és a BK-i kontraktilitás között
Erős korrelációt figyeltünk meg az előterheléstől független BK-i kontraktilitásparaméterek (ESPVR, PRSW és dP/dtmax-EDV) és a miofilamentáris Ca2+-érzékenység (pCa50) között (5–7. ábrák).

Megbeszélés

Jelen tanulmányunkban elsőként mutattuk ki, hogy a permeabilizált szívizomsejteken mért Ca2+-érzékenység (pCa50) és a nyomás-térfogat analízissel számított BK-i kontraktilitásparaméterek között (ESPVR, PRSW, dP/dtmax-EDV) erős korreláció áll fenn a fokozott nyomásterhelés által előidézett BKH patkánymodelljében. Eredményeink arra engednek következtetni, hogy a miofilamentáris rendszer Ca2+-érzékenységében bekövetkező változások hozzájárulhatnak a BK-i kontraktilitásváltozásokhoz a patológiás BKH kialakulása és progressziója során.

Az abdominális aortaszűkítés által előidézett BKH morfológiai és molekuláris jellemzése
Kísérleteinkben a BK fokozott utóterhelését az abdominalis aorta műtéti beszűkítésével idéztük elő. Korábbi tapasztalatainknak megfelelően (5, 7, 8, 17) az aortaszűkített csoportokban jelentős mértékű BKH fejlődött ki, amit az echokardiográfiás utánkövetés (megnövekedett falvastagságok és LVmass index) (1. B–D ábrák), a posztmortem szervtömegmérések (megnövekedett HW/TL arány) és a szövettani elemzés (emelkedett CD) egyaránt igazolt (2. A–C ábrák). A BKH patológiás jellegét a fötális gének reaktivációja bizonyította (emelkedett β/α-MHC arány és ANP mRNS-szintek) (2. D–E ábrák) (18). Mindezen morfológiai és molekuláris változások már 6 héttel az aortaszűkítést követően jelen voltak. A későbbi időpontokban (12 és 18 hét elteltével) az aortaszűkített csoportokban a kamradilatáció és a progresszív intersticiális kollagén-felhalmozódás jelei is megfigyelhetővé váltak (1. E, 2. F ábrák), amelyek szintén összhangban állnak a korábbi megfigyelésekkel (19).

A BK funkciójában bekövetkező változások a fokozott nyomásterhelés által indukált BKH kialakulása és progressziója során
A nyomás-térfogat analízis a BK kontraktilitását megbízhatóan mérő in vivo hemodinamikai módszer (3). A módszer fontos sajátsága, hogy a nyomás–térfogat-hurkok részletes elemzése vena cava okklúziós manőver alkalmazása mellet lehetővé teszi az elő- és utóterheléstől független kontraktilitás-paraméterek kiszámítását. Ez különösen fontos olyan kórállapotokban, ahol az elő- és/vagy utóterhelés jelentősen változik, ezzel lehetetlenné téve a BK-funkció korrekt jellemzését a konvencionális funkcionális paraméterekkel. Jelen tanulmányunkban ezért a nyomás-térfogat analízist alkalmaztuk a BK-funkció pontos hemodinamikai jellemzésére.

A fokozott nyomásterhelés által előidézett BKH korai stádiuma
A fokozott nyomásterhelés által előidézett BKH kezdeti stádiumát károsodott diasztolés funkció (főként megnyúlt aktív relaxáció) (20), és megtartott szisztolés működés jellemzi. E korai stádiumban a konvencionális, elő- és utóterheléstől függő szisztolés paraméterek nem változnak. Ugyanakkor, nyomás-térfogat analízis technikával a BK-i kontraktilitás fokozódása mutatható ki (5, 7, 17). A kontraktilitás ezen kompenzatórikus emelkedése biztosítja a BK alkalmazkodását a megnövekedett artériás utóterheléshez. Az abdominális AB-modellel kapcsolatos korábbi tapasztalataink alapján a 6. hetet választottuk a BKH korai fázisának tanulmányozásához (5, 17). Hemodinamikai méréseink igazolták, hogy az AB-csoportot ebben az időpontban valóban károsodott diasztolés funkció (megnyúlt Tau-értékek) és megtartott szisztolés funkció jellemezte. Emellett a BK-i kontraktilitás pontos jellemzése céljából három, széles körben elfogadott, elő- és utóterheléstől független kontraktilitásparamétert (ESPVR, PRSW, dP/dtmax-EDV) számítottunk (3). Mind a három paraméter megnövekedett BK-i kontraktilitást igazolt az AB-csoportban (4. B, 5. B, 6. B ábrák). A változatlan VAC-arány jelezte, hogy a BK-i kontraktilitás emelkedése eredményesen kompenzálta az artériás rendszerben uralkodó fokozott utóterhelést (1. táblázat). Mérési eredményeink tehát igazolták, hogy hemodinamikai szempontból az AB-6hét csoport megfelelt a fokozott nyomásterhelés által előidézett BKH korai stádiumának.

A fokozott nyomásterhelés által indukált BKH előrehaladott stádiuma
A fokozott nyomásterhelés által indukált patológiás BKH esetében a kontraktilitás növekedése csak ideiglenes alkalmazkodást tesz lehetővé, ugyanis a kezdeti kompenzatórikus kontraktilitás-fokozódás a progresszió során regrediál (6, 7). Korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy a szisztolés funkció dekompenzációjának időpontja krónikus nyomásterhelés által előidézett BKH állatmodelljeiben függ a kísérleti állat fajától, az aortaszűkítés helyétől (mellkas vagy has) és a szűkület súlyosságától (21). Az abdominális AB-modellel folytatott korábbi kísérleteink alapján hím patkányok esetében a „kompenzált” BKH-ból a szisztolés diszfunkcióba való átmenet a krónikus nyomásterhelés 12. hetében várható (7). Ennek megfelelően a 12. és 18. hetet választottuk jelen tanulmányunkban az előrehaladott BKH tanulmányozására. A nyomás-térfogat analízisből számolt adatok alapján ezekben az időpontokban a BK-i kontraktilitásparaméterek jelentősen csökkentek a korai fázishoz képest (AB-6hét csoport) (4. B, 5. B, 6. B ábrák). A hiperkontraktilis állapot dekompenzációja a változatlanul fennálló fokozott artériás ellenállás (Ea) mellett a BK-i kontraktilitás és az utóterhelés egyensúlyának felbomlásához vezetett (csökkent VAC-arány) (1. táblázat). A kamrai szisztolés teljesítmény romlása ezekben az időpontokban az előterheléstől függő paraméterek (pl. EF) enyhe csökkenésében nyilvánult meg (1. táblázat). Az aortaszűkített csoportban emellett a 18. héten a diasztolés funkció mindkét aspektusának (aktív relaxáció és passzív feszülés) jelentős romlása is megfigyelhető volt (1. táblázat).

Miofilamentáris funkció fokozott nyomásterhelés által indukált BKH-ban és ennek összefüggése a BK-funkcióval
Tekintve, hogy a BK-i kontraktilitás, azaz a szívizomsejtek erőkifejtése a szarkomerfunkció függvénye, felmerül, hogy a BKH kialakulása és progressziója során változások mehetnek végbe a miofilamentáris funkcióban is (22). Ezt támasztja alá, hogy korábbi kísérletes munkák megnövekedett, változatlan és csökkent szarkomerfunkciót is leírtak a patológiás BKH különböző stádiumaiban (9–11, 23). Ugyanakkor ezek a tanulmányok számos limitációval rendelkeznek. A legtöbb korábbi kísérlet a miofilamentáris funkciót csak egy bizonyos időpontban vizsgálta, így nem rendelkezünk adattal a szarkomerfunkció időbeli változásait illetően. Továbbá, egyik említett tanulmány sem vizsgálta a BK-i kontraktilitás és a miofilamentáris funkció kapcsolatát. Arról tehát, hogy a miofilamentáris rendszerben leírt változások hogyan hatnak a teljes BK hemodinamikai jellemzőire, még korlátozottak az ismereteink. Ezért jelen tanulmányunkban párhuzamosan vizsgáltuk a BK kontraktilitását és a miofilamentáris funkció változását a BKH kialakulása és progressziója során.

A fokozott nyomásterhelés által indukált BKH korai stádiuma
A fentebb leírtak szerint a fokozott nyomásterhelés által előidézett BKH korai fázisára (AB-6hét csoport) emelkedett BK-i kontraktilitás (ESPVR, PRSW, dP/dtmax-EDV) volt jellemző. Ugyanebben a kísérleti csoportban emelkedett Ca2+-érzékenységet (pCa50) és változatlan Fmax-értéket mértünk permeabilizált szívizomsejteken (3. ábra és 1. táblázat). Ez az eredmény arra enged következtetni, hogy a miofilamentáris rendszer fokozott Ca2+-érzékenysége lehet felelős a kontraktilitás növekedéséért a BKH korai stádiumában. Bár e két jelenség (fokozott Ca2+-érzékenység szarkomerszinten és fokozott kontraktilitás a BK szintjén) között ezen összefüggést még nem tárták fel, a szarkomer Ca2+-érzékenységének növekedése patológiás BKH-ban megőrzött szisztolés funkció mellett ismert az irodalomban (9, 24). Ezt kiegészítve, megvizsgáltuk a Ca2+-érzékenységet leginkább meghatározó cTnI és cMyBP-C fehérjék specifikus szabályozó helyeinek foszforiláltsági állapotát. Méréseink a foszforiláltság nagyfokú növekedését jelezték a PKC-mediált cTnI Thr-144 helyén az AB-6hét csoportban (4. C ábra). Eredményeinkkel összhangban korábbi kutatások kimutatták, hogy a cTnI pszeudo-foszforilációja a Thr-143/144 (Thr-143 emberben és Thr-144 egérben/patkányban) helyeken potenciálisan növeli a miofilamentáris Ca2+-érzékenységet (25, 26). Érdekes módon a Thr-143 oldallánc hiperfoszforilációja nem volt hatással a maximális szarkomererő növekedésére humán permeabilizált szívizomsejtekben (25), ami szintén összhangban áll azzal a megfigyelésünkkel, miszerint az AB-6hét csoportban az Fmax-érték nem változott (1. táblázat). Figyelembe véve azt a tényt, hogy sem a cTnI (Ser-22/23 és Ser-43) sem a cMyBP-C (Ser-282) egyéb vizsgált oldalláncain nem történt változás, feltételezhetjük, hogy a cTnI PKC-specifikus Thr-144 helyen történő hiperfoszforilációja állt a miofilamentáris rendszer emelkedett Ca2+-érzékenységének hátterében.

A fokozott nyomásterhelés által előidézett BKH előrehaladott stádiuma
A nyomás-térfogat analízisből származó eredményeink alapján a BKH előrehaladottabb stádiumaiban a kontraktilitás kompenzatorikus növekedése regrediált (5. B, 6. B, 7. B ábrák). Ezzel párhuzamosan azt találtuk, hogy a sejtszintű (miofilamentáris rendszer Ca2+-érzékenységének növekedése) és a molekuláris szintű (cTnI hiperfoszforilációja a PKC-specifikus Thr-144 helyen) adaptációk a 12. és 18. hétre eltűntek az AB-csoportokban (3. és 4. C ábrák).

A BKH-t előrehaladottabb stádiumban vizsgáló korábbi tanulmányok normális vagy csökkent Ca2+-érzékenységet figyeltek meg izolált és permeabilizált szívizomsejt-készítményeken. Egy spontán hipertenzív szívelégtelen patkánytörzs vizsgálata során például sem a pCa50, sem az Fmax-értékei nem különböztek a kontrollcsoport értékeitől (23). Emellett az aortaív szűkítése által okozott végstádiumú szívelégtelenség patkánymodelljében a miofilamentáris rendszer funkciójának mindkét komponensében (pCa50, Fmax) jelentős csökkenést tapasztaltak (10, 11). Fontos megjegyezni, hogy ebben a vizsgálatban az aortaív-szűkület nagyon súlyos mértékű volt és viszonylag hosszú ideig állt fenn (36 hétig), így feltételezhető, hogy a BKH és a szívelégtelenség egy sokkal előrehaladottabb állapotot ért el mind az általunk alkalmazott abdominalis AB, mind a spontán hipertenzív modellhez képest.

Az irodalmi adatokra és saját kutatásainkra alapozva feltételezzük, hogy a miofilamentáris Ca2+-érzékenység növekedése (a PKC-specifikus cTnI Thr-144 helyen történő hiperfoszforiláció következtében) egy korai, ideiglenes kompenzációs mechanizmusként működik a BK fokozott nyomásterhelése esetén. A Ca2+-érzékenység ezen emelkedése visszaalakul a kompenzált BKH-ból szívelégtelenségbe történő átmenetkor, majd jelentősen csökken végstádiumú szívelégtelenségben.

Következtetések

Jelen tanulmányunkban kimutattuk, hogy a fokozott nyomásterhelés által indukált BKH korai stádiumára a BK szintjén fokozott kontraktilitás, a szarkomer szintjén pedig emelkedett Ca2+-érzékenység (a cTnI PKC-specifikus Thr-144 helyen történő hiperfoszforilációja miatt) jellemző. Ez a korai funkcionális alkalmazkodás kompenzálja a megnövekedett artériás utóterhelést, és ezzel fenntartja a fiziológiás ventrikulo-arteriális kapcsolást (VAC) és szisztolés funkciót. A betegség előrehaladottabb állapotában ugyanakkor a BK megnövekedett kontraktilitása és a miofilamentáris rendszer Ca2+-érzékenységének növekedése egyaránt regrediál. A kompenzáció hiánya a VAC romlásához, ezáltal a szisztolés teljesítmény károsodásához vezet. Eredményeink arra engednek következtetni, hogy a miofilamentáris Ca2+-érzékenységben bekövetkező változások hozzájárulhatnak a BK-i kontraktilitás dinamikus változásaihoz a fokozott nyomásterhelés által előidézett BKH kialakulása és progressziója során.

Köszönetnyilvánítás
Elismerés illeti Patricia Kraft, Tobias Mayer, Karin Sonnenberg, Lutz Hoffmann, Gregor Viktória, Gephard Alexandra, Urbán Edina, Biró Henriett és Samodai Erika munkáját.

Támogatás
Jelen munkánkat a Nemzeti Kutatási, Fejlesztési és Innovációs Hivatal – NKFIA (NVKP-16-1-2016-0017, „Nemzeti Szívprogram”); az Emberi Erőforrások Minisztériuma ÚNKP-18-3-I-SE-9 (R.M.) és ÚNKP-18-3-III-DE-387 (B. B.) kódszámú Új Nemzeti Kiválóság Programjai, a Magyar Tudományos Akadémia (P. Z.; 11003), a Magyar Tudományos Akadémia Bolyai János Kutatási Ösztöndíja (R.T.), GINOP-2.3.2-15-2016-00048 projekt (P.Z.), a Baden-Württemberg tartomány és a Ruprecht-Karls Egyetem Orvostudományi Kara (S.K-I.) támogatta.

Irodalom

1. Ruppert M, Bodi B, Korkmaz-Icoz S, Loganathan S, Jiang W, Lehmann L, et al. Myofilament Ca2+ sensitivity correlates with left ventricular contractility during the progression of pressure overload-induced left ventricular myocardial hypertrophy in rats. Journal of molecular and cellular cardiology 2019; 129: 208–18. doi: https://doi.org/10.1016/j.yjmcc.2019.02.017

2. Davidson BP, Giraud GD. Left ventricular function and the systemic arterial vasculature: remembering what we have learned. Journal of the American Society of Echocardiography : official publication of the American Society of Echocardiography 2012; 25: 891–4. doi: https://doi.org/10.1016/j.echo.2012.06.020

3. Pacher P, Nagayama T, Mukhopadhyay P, Batkai S, Kass DA. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc 2008; 3: 1422–34. doi: https://doi.org/10.1038/nprot.2008.138

4. Chen J, Chemaly ER, Liang LF, LaRocca TJ, Yaniz-Galende E, Hajjar RJ. A new model of congestive heart failure in rats. American journal of physiology Heart and circulatory physiology 2011; 301: H994–1003. doi: https://doi.org/10.1152/ajpheart.00245.2011

5. Nemeth BT, Matyas C, Olah A, Lux A, Hidi L, Ruppert M, et al. Cinaciguat prevents the development of pathologic hypertrophy in a rat model of left ventricular pressure overload. Scientific reports 2016; 6: 37166. doi: https://doi.org/10.1038/srep37166

6. Ku HC, Su MJ. DPP4 deficiency preserved cardiac function in abdominal aortic banding rats. PloS one 2014; 9: e85634. doi: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0085634

7. Ruppert M, Korkmaz–Icoz S, Loganathan S, Jiang W, Lehmann LH, Olah A, et al. Pressure-volume analysis reveals characteristic sex-related differences in cardiac function in a rat model of aortic banding-induced myocardial hypertrophy. American journal of physiology Heart and circulatory physiology 2018. doi: https://doi.org/10.1152/ajpheart.00202.2018

8. Ruppert M, Korkmaz-Icoz S, Li S, Nemeth BT, Hegedus P, Brlecic P, et al. Myocardial reverse remodeling after pressure unloading is associated with maintained cardiac mechanoenergetics in a rat model of left ventricular hypertrophy. American journal of physiology Heart and circulatory physiology 2016; 311: H592–603. doi: https://doi.org/10.1152/ajpheart.00085.2016

9. Hamdani N, Bishu KG, von Frieling-Salewsky M, Redfield MM, Linke WA. Deranged myofilament phosphorylation and function in experimental heart failure with preserved ejection fraction. Cardiovascular research 2013; 97: 464–71. doi: https://doi.org/10.1093/cvr/cvs353

10. Belin RJ, Sumandea MP, Kobayashi T, Walker LA, Rundell VL, Urboniene D, et al. Left ventricular myofilament dysfunction in rat experimental hypertrophy and congestive heart failure. American journal of physiology Heart and circulatory physiology 2006; 291: H2344–53. doi: https://doi.org/10.1152/ajpheart.00541.2006

11. Belin RJ, Sumandea MP, Sievert GA, Harvey LA, Geenen DL, Solaro RJ, et al. Interventricular differences in myofilament function in experimental congestive heart failure. Pflugers Archiv : European journal of physiology 2011; 462: 795–809. doi: https://doi.org/10.1007/s00424-011-1024-4

12. Sunagawa K, Maughan WL, Burkhoff D, Sagawa K. Left ventricular interaction with arterial load studied in isolated canine ventricle. The American journal of physiology 1983; 245: H773–80. doi: https://doi.org/10.1152/ajpheart.1983.245.5.H773

13. Yamamoto K. The time constant of left ventricular relaxation: extrication from load dependence and overestimation of functional abnormality. Circulation Heart failure 2010; 3: 178–80. doi: https://doi.org/10.1161/CIRCHEARTFAILURE.110.941773

14. Kass DA, Beyar R, Lankford E, Heard M, Maughan WL, Sagawa K. Influence of contractile state on curvilinearity of in situ end-systolic pressure-volume relations. Circulation 1989; 79: 167–78.

15. Kass DA, Kelly RP. Ventriculo-arterial coupling: concepts, assumptions, and applications. Annals of biomedical engineering 1992; 20: 41–62.

16. Ruppert M, Korkmaz-Icoz S, Li S, Merkely B, Karck M, Radovits T, et al. Reverse electrical remodeling following pressure unloading in a rat model of hypertension-induced left ventricular myocardial hypertrophy. Hypertension research : official journal of the Japanese Society of Hypertension 2017; 40: 637–45. doi: https://doi.org/10.1038/hr.2017.1

17. Olah A, Nemeth BT, Matyas C, Hidi L, Lux A, Ruppert M, et al. Physiological and pathological left ventricular hypertrophy of comparable degree is associated with characteristic differences of in vivo hemodynamics. American journal of physiology Heart and circulatory physiology 2016; 310: H587–97. doi: https://doi.org/10.1152/ajpheart.00588.2015

18. McMullen JR, Jennings GL. Differences between pathological and physiological cardiac hypertrophy: novel therapeutic strategies to treat heart failure. Clinical and experimental pharmacology & physiology 2007; 34: 255–62. doi: https://doi.org/10.1111/j.1440-1681.2007.04585.x

19. Litwin SE, Katz SE, Weinberg EO, Lorell BH, Aurigemma GP, Douglas PS. Serial echocardiographic-Doppler assessment of left ventricular geometry and function in rats with pressure-overload hypertrophy. Chronic angiotensin-converting enzyme inhibition attenuates the transition to heart failure. Circulation 1995; 91: 2642–54.

20. Douglas PS, Berko B, Lesh M, Reichek N. Alterations in diastolic function in response to progressive left ventricular hypertrophy. Journal of the American College of Cardiology 1989; 13: 461–7.

21. Gomes AC, Falcao-Pires I, Pires AL, Bras-Silva C, Leite-Moreira AF. Rodent models of heart failure: an updated review. Heart failure reviews 2013; 18: 219–49. doi: https://doi.org/10.1007/s10741-012-9305-3

22. Hamdani N, Kooij V, van Dijk S, Merkus D, Paulus WJ, Remedios CD, et al. Sarcomeric dysfunction in heart failure. Cardiovascular research 2008; 77: 649–58. doi: https://doi.org/10.1093/cvr/cvm079

23. Perreault CL, Bing OH, Brooks WW, Ransil BJ, Morgan JP. Differential effects of cardiac hypertrophy and failure on right versus left ventricular calcium activation. Circulation research 1990; 67: 707–12.

24. Fraysse B, Weinberger F, Bardswell SC, Cuello F, Vignier N, Geertz B, et al. Increased myofilament Ca2+ sensitivity and diastolic dysfunction as early consequences of Mybpc3 mutation in heterozygous knock-in mice. Journal of molecular and cellular cardiology 2012; 52: 1299–307. doi: https://doi.org/10.1016/j.yjmcc.2012.03.009

25. Wijnker PJ, Sequeira V, Foster DB, Li Y, Dos Remedios CG, Murphy AM, et al. Length-dependent activation is modulated by cardiac troponin I bisphosphorylation at Ser23 and Ser24 but not by Thr143 phosphorylation. American journal of physiology Heart and circulatory physiology 2014; 306: H1171–81. doi: https://doi.org/10.1152/ajpheart.00580.2013

26. Wang H, Grant JE, Doede CM, Sadayappan S, Robbins J, Walker JW. PKC-betaII sensitizes cardiac myofilaments to Ca2+ by phosphorylating troponin I on threonine-144. Journal of molecular and cellular cardiology 2006; 41: 823–33. doi: https://doi.org/10.1016/j.yjmcc.2006.08.016